1. ガイドと切断酵素を組み合わせる

CRISPR-Cas9編集は、細菌の外来DNAに対する防御機構から発展した道具です。ここではStreptococcus pyogenes由来のSpCas9を扱います。CRISPRのすべての系が同じ酵素、PAM、切断様式を使うわけではありません。

自然界のcrRNAとtracrRNAはCas9とともに働きます。研究用の単一ガイドRNA（sgRNA）は両者の役割を一分子にまとめた設計です。標的に対応するガイド部分を変えると別のDNA位置を狙えますが、望む配列を狙うことと、望む編集結果だけを得ることは別です。

2. PAMと二本のDNA鎖の切断

SpCas9には、ガイドに対応するDNA配列の隣にPAMが必要です。代表的なPAMは5′-NGG-3′で、Nは任意の塩基を意味します。PAMは標的DNA側の条件であり、ガイドに付け加える3塩基部分ではありません。

Jinekらの2012年の生化学実験では、HNHドメインがガイドと相補的なDNA鎖を、RuvC様ドメインが反対の鎖を切りました。プラスミド実験の代表的な切断位置はPAMの3塩基対上流でしたが、短いDNA基質の非相補鎖ではより幅広い切断位置も観察されました。すべての基質で完全に同じ切断面になると一般化してはいけません。この研究は二つのRNAを結合したガイドで切断を再指定できることも示しました。

3. 切断後の結果は細胞の修復が決める

Congらの2013年の研究は、ヒトとマウスの細胞で標的位置の編集を示しました。非相同末端結合（NHEJ）による修復は挿入・欠失（indel）を生じることがあります。ただしindelがあるだけでタンパク質の機能喪失を確定できません。実際の変異配列と、その遺伝子の機能を確認する必要があります。

相同配列を持つドナーDNAを使う修復（HDR）は、望む配列変化に利用できます。同じ研究のEMX1実験では修復鋳型で制限酵素認識部位を導入し、配列解析で確認しました。ドナーを加えただけですべての細胞に望む変化が生じるわけではありません。

論文を読むときは、切断の証拠 → 修復されたDNA配列 → RNA・タンパク質または機能の変化を分けて確認します。原著はSURVEYOR解析とSanger配列解析を使い、異なる挿入・欠失結果を示しています。この順序は読者向けの説明で、ここで実行した実験ではありません。ガイドと標的の不一致を一部許容した結果もあるため、標的位置での成功だけで標的外切断がないとは結論できません。臨床治療や農業品種の効果・安全性は、この基礎実験とは別に検証する必要があります。

4. 出典