1. 가이드와 절단 효소를 함께 쓰는 도구

CRISPR-Cas9 편집은 세균의 외래 DNA 방어 기구에서 발전한 도구입니다. 여기서는 Streptococcus pyogenes 유래 SpCas9를 다룹니다. CRISPR 계열 전체가 같은 효소, 같은 PAM, 같은 절단 방식을 사용하는 것은 아닙니다.

자연계의 crRNA와 tracrRNA는 Cas9의 작동을 함께 돕습니다. 연구용 단일 가이드 RNA(sgRNA)는 이 두 RNA의 역할을 한 분자로 결합한 설계입니다. 표적에 맞춘 가이드 부분을 바꾸면 다른 DNA 위치를 겨냥할 수 있지만, ‘원하는 서열을 겨냥한다’와 ‘원하는 편집 결과만 얻는다’는 별개입니다.

2. PAM과 두 DNA 가닥의 절단

SpCas9 표적에는 가이드와 대응하는 DNA 서열 외에 인접한 PAM이 필요합니다. 대표적인 PAM은 5′-NGG-3′이며 N은 어느 염기든 가능하다는 뜻입니다. PAM은 표적 DNA의 조건이지 가이드에 함께 붙여 넣는 3염기 부분이 아닙니다.

Jinek 등의 2012년 생화학 실험에서 HNH 도메인은 가이드와 상보적인 DNA 가닥을, RuvC 유사 도메인은 반대 가닥을 잘랐습니다. 플라스미드 실험의 대표적인 절단 위치는 PAM에서 3염기쌍 위쪽이었지만, 짧은 DNA 기질의 비상보 가닥에서는 더 넓은 절단 위치도 관찰됐습니다. 따라서 모든 기질에서 완전히 같은 ‘깨끗한 절단면’이 나온다고 일반화하지 않습니다. 연구는 두 RNA를 연결한 가이드로 절단을 재지정할 수 있다는 점도 보여줬습니다.

3. 절단 뒤 결과는 세포 복구가 결정한다

Cong 등의 2013년 연구는 사람·생쥐 세포의 표적 위치에서 편집을 보여줬습니다. 비상동 말단 연결(NHEJ)을 통한 복구는 삽입·결실(indel)을 만들 수 있습니다. 하지만 indel이 있다는 것만으로 단백질 기능이 사라졌다고 확정할 수 없습니다. 정확한 변이 서열과 해당 유전자의 기능을 확인해야 합니다.

공여 DNA의 상동 서열을 이용하는 복구(HDR)는 원하는 서열 변화에 쓰일 수 있습니다. 같은 연구의 EMX1 실험에서는 복구 주형으로 제한효소 인식 부위를 도입하고 서열 분석으로 확인했습니다. 주형을 함께 넣었다는 사실만으로 모든 세포에 원하는 변화가 생긴다는 뜻은 아닙니다.

논문 결과를 읽을 때 절단 증거 → 복구된 DNA 서열 → RNA·단백질 또는 기능 변화를 나눠 확인하면 도움이 됩니다. 원 논문은 SURVEYOR 분석과 Sanger 서열 분석을 사용했고 서로 다른 삽입·결실 결과를 제시했습니다. 이 판독 순서는 독자를 위한 설명이며 여기서 실행한 실험이 아닙니다. 가이드와 표적 사이의 불일치를 일부 허용한 결과도 있으므로, 표적 위치의 성공만으로 비표적 절단이 없다고 결론 내리면 안 됩니다. 임상 치료나 농업 품종의 효과·안전성은 이 기초 실험과 별도 검증 대상입니다.

4. 출처